§1
실험 개요
HPLC는 GC가 적용 불가능한 비휘발성·열불안정 화합물(약물·단백질·비타민)을 분리하는 표준 기법이다. 학부에서는 카페인·아세트아미노펜 같은 의약품을 C18 역상 컬럼에서 분리·정량한다.
§2
이론 배경
역상 분리
고정상이 비극성(C18), 이동상이 극성(물 + 메탄올/아세토니트릴). 비극성 화합물일수록 컬럼에 오래 머묾 → 늦은 tR.
isocratic vs gradient
isocratic: 이동상 조성 일정, 단순 분리에 적합. gradient: 시간에 따라 조성 변화, 다양한 극성 시료에 유리.
§3
실험 장치 및 시약
- — HPLC 시스템(펌프, 인젝터, 컬럼, UV 검출기)
- — C18 컬럼
- — 이동상
- — 표준 시약
§4
실험 절차
- 1.이동상(물:메탄올 70:30) 준비, 탈기.
- 2.유속 1 mL/min, UV 254 nm 설정.
- 3.표준액 20 μL 주입, 크로마토그램 기록.
- 4.다양한 농도 표준으로 검량선, 미지 시료 정량.
§5
데이터 처리
피크 면적 vs 농도 직선 회귀로 미지 시료 농도 결정. 분해능·이론단수(N) 평가.
§6
예비보고서 항목별 작성 팁
이론
역상과 정상상의 차이, 왜 학부에서 역상이 일반적인지 설명.
§7
자주 하는 실수
- — 이동상 탈기 부실로 펌프 압력 변동
- — 주입 용매가 이동상보다 강한 용매라서 피크 broadening
- — 컬럼 온도 변동 보정 안 함
§8
자주 묻는 질문
Q. 왜 역상이 더 일반적인가요?
분석 대상의 90% 이상이 어느 정도 비극성을 가지기 때문입니다. 이동상이 극성(물+유기용매)이라 폐기·취급도 안전하며, C18 컬럼이 견고하고 재현성이 좋습니다.
Q. 유속을 두 배로 올리면 어떻게 되나요?
분석 시간은 절반, 압력은 두 배. 분해능은 약간 감소(plate height 증가). 빠른 분석을 원하면 유속 증가, 정밀 분리를 원하면 유속 감소가 일반 원칙입니다.
§9
참고 표준·문헌
본 가이드는 다음 표준·교과서·핸드북의 정의·식·표준 절차를 따라 작성되었습니다. 학교 양식과 표준 절차가 다를 경우 학교 양식을 우선합니다.
- [1]Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., Crouch, S.R. — Fundamentals of Analytical Chemistry, 9th ed., Cengage, 2013
- [2]Harris, D.C. — Quantitative Chemical Analysis, 10th ed., Freeman, 2020