실험 개요
ELISA는 면역학·진단·연구에서 단백질·호르몬·바이러스 항원의 정량에 가장 보편적인 기법이다. 마이크로플레이트에 항체를 고정하고 항원과 결합시킨 뒤 효소-기질 반응으로 색을 발색시켜 농도를 정량한다.
이론 배경
ELISA 형식
Direct: 항원 → 효소 결합 항체. Indirect: 항원 → 1차 항체 → 효소 결합 2차 항체. Sandwich: 포획 항체 → 항원 → 검출 항체. Sandwich가 감도·특이도가 가장 높음.
효소-기질
HRP + TMB → 청색(450 nm). ALP + pNPP → 노란색(405 nm). 효소가 신호를 증폭해 pg/mL 수준 검출 가능.
실험 장치 및 시약
- — 96-well 마이크로플레이트
- — 마이크로피펫
- — 플레이트 reader
- — 항체·기질 시약
실험 절차
- 1.포획 항체로 plate 코팅, 4°C 밤샘 incubation.
- 2.blocking buffer로 비특이 결합 차단.
- 3.표준 시료·미지 시료 가하고 1시간 incubation.
- 4.검출 항체-효소 conjugate 가하고 incubation.
- 5.기질 가해 발색, 1 N H₂SO₄로 정지 후 흡광도 측정.
데이터 처리
표준 농도 vs A450 검량선 작성(보통 4-parameter logistic). 미지 시료 흡광도를 검량선에 대입해 농도 산출.
예비보고서 항목별 작성 팁
이론
Sandwich ELISA의 두 항체가 어떻게 다른 epitope을 인식해야 하는지 설명.
안전
HRP 기질(TMB)·정지액(H₂SO₄) 취급 주의.
자주 하는 실수
- — blocking 부족으로 비특이 신호 큼
- — well 사이 시약 cross-contamination
- — incubation 시간이 표준에서 벗어나 흡광도 비선형
자주 묻는 질문
Q. 왜 blocking이 필요한가요?
포획 항체 결합 후 빈 자리에 검출 항체가 비특이적으로 붙으면 background 신호가 커져 정량이 부정확해집니다. BSA·casein·skim milk 같은 단백질로 빈 표면을 덮으면 비특이 결합을 크게 줄일 수 있습니다.
Q. Sandwich ELISA 두 항체는 왜 다른 epitope을 봐야 하나요?
같은 epitope을 인식하면 한쪽이 결합한 자리에 다른 쪽이 붙을 수 없어 신호가 안 나옵니다. 항원에 두 개 이상의 epitope이 있어야 하며, 그래서 monomeric 작은 항원에는 sandwich가 어렵고 indirect 또는 competitive ELISA를 씁니다.
참고 표준·문헌
본 가이드는 다음 표준·교과서·핸드북의 정의·식·표준 절차를 따라 작성되었습니다. 학교 양식과 표준 절차가 다를 경우 학교 양식을 우선합니다.
- [1]Nelson, D.L., Cox, M.M. — Lehninger Principles of Biochemistry, 8th ed., Macmillan, 2021
- [2]Green, M.R., Sambrook, J. — Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., CSHL Press, 2012