§1
실험 개요
Western blot은 특정 단백질의 발현 여부와 양을 검사하는 표준 기법이다. SDS-PAGE로 크기별로 분리한 단백질을 PVDF/니트로셀룰로스 막에 전사하고, 1차 항체와 효소 conjugated 2차 항체로 ECL 발광 검출한다.
§2
이론 배경
전사 메커니즘
전기장으로 젤 안의 단백질을 막으로 이동. wet transfer(buffer 용기)와 semi-dry(샌드위치)가 일반적. 효율은 단백질 크기·전사 시간·전압에 의존.
검출
1차 항체 → 표적 단백질 결합. HRP-2차 항체 → 1차 결합. ECL 기질이 HRP에 의해 발광 → X-ray 필름 또는 CCD 카메라.
§3
실험 장치 및 시약
- — 전사 장치
- — PVDF/니트로셀룰로스 막
- — blocking buffer (5% milk)
- — 1차·2차 항체
- — ECL 기질
§4
실험 절차
- 1.SDS-PAGE 전개 완료한 젤을 PVDF 막에 100 V, 1시간 전사.
- 2.TBST로 세척 후 5% skim milk로 1시간 blocking.
- 3.1차 항체(1:1000) 4°C 밤샘 incubation.
- 4.TBST 세척 → 2차 항체(1:5000) 1시간 incubation.
- 5.ECL 기질 처리 후 영상 캡처.
§5
데이터 처리
표적 밴드의 강도를 ImageJ로 정량. β-actin 같은 내부 대조군으로 정규화. 그룹 간 비교는 평균 + 표준편차.
§6
예비보고서 항목별 작성 팁
이론
왜 SDS가 단백질을 음전하로 만들고 크기 분리가 가능한지 설명.
§7
자주 하는 실수
- — 전사 효율 부족으로 큰 단백질이 막에 안 올라감
- — blocking 부실로 background 큼
- — ECL 노출 시간 길어서 saturation
§8
자주 묻는 질문
Q. PVDF와 니트로셀룰로스 중 무엇을 쓰나요?
PVDF는 단백질 결합력이 강하고 재사용·stripping 가능, 시료가 적을 때 권장. 니트로셀룰로스는 background가 낮고 발색 검출에 좋지만 강한 detergent에 약함. 일반적으로 PVDF가 더 많이 쓰입니다.
Q. loading control(β-actin)이 왜 필요한가요?
각 well에 로드한 단백질 총량이 정확히 같지 않을 수 있고, 전사 효율도 불균일합니다. 시료마다 거의 일정하게 발현되는 단백질로 정규화해야 표적 단백질 양을 다른 시료와 비교할 수 있습니다.
§9
참고 표준·문헌
본 가이드는 다음 표준·교과서·핸드북의 정의·식·표준 절차를 따라 작성되었습니다. 학교 양식과 표준 절차가 다를 경우 학교 양식을 우선합니다.
- [1]Green, M.R., Sambrook, J. — Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., CSHL Press, 2012
- [2]Nelson, D.L., Cox, M.M. — Lehninger Principles of Biochemistry, 8th ed., Macmillan, 2021