실험 개요
Bradford는 단백질 정량의 가장 보편적 기법으로, Coomassie Brilliant Blue G-250이 단백질의 양이온 잔기에 결합하면서 갈색(465 nm)에서 청색(595 nm)으로 변하는 흡광 변화를 이용한다. 학부에서는 BSA 표준액으로 검량선을 그리고 미지 시료의 농도를 결정한다.
이론 배경
염료 결합 메커니즘
Coomassie의 음이온 형태가 단백질의 Arg, Lys, His 잔기와 비공유적으로 결합. 결합 시 안정화되며 최대 흡광이 465 → 595 nm로 이동.
Beer–Lambert와 검량선
595 nm 흡광도가 단백질 농도에 비례하지만 직선 영역이 좁다(보통 0.1~1.5 mg/mL). BSA로 5~6점 검량선을 그려 미지 시료의 농도를 결정.
단백질 종류 의존성
Arg 함량이 다르면 같은 농도에서도 흡광이 다름. BSA로 만든 검량선은 다른 단백질에 적용 시 ±20% 이내 오차. 정확한 정량에는 BCA·Lowry가 더 적합한 경우도 있음.
실험 장치 및 시약
- — 분광광도계
- — Bradford 시약(시판 또는 자가제조)
- — BSA 표준액(1 mg/mL)
- — 마이크로큐벳 또는 96-well plate
실험 절차
- 1.BSA 표준액으로 0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/mL 단계 농도를 만든다.
- 2.각 표준액 20 μL에 Bradford 시약 1 mL를 더해 5분간 발색.
- 3.595 nm에서 흡광도 측정 후 검량선 작성.
- 4.미지 시료를 동일 절차로 측정해 검량선에서 농도 산출.
데이터 처리
A vs C 직선 회귀, R² ≥ 0.99. 미지 시료 흡광도가 직선 범위에 들어오도록 적절한 희석을 사용. 농도 = (A − b₀)/m × 희석배수.
예비보고서 항목별 작성 팁
이론
Coomassie의 양·음이온 형태 평형이 흡광 변화의 본질임을 적는다.
예상 결과
검량선의 직선 범위와 R² 기준을 미리 명시.
자주 하는 실수
- — Bradford 시약 첨가 후 너무 늦게 측정해 침전이 생기는 것 (5~30분 안)
- — 검량선 외삽으로 농도를 추정하는 것
- — BSA 검량선을 다른 단백질에 그대로 적용하면서 오차 가능성을 명시하지 않는 것
자주 묻는 질문
Q. 왜 Bradford는 595 nm에서 측정하나요?
Coomassie–단백질 복합체의 최대 흡광이 595 nm이기 때문입니다. 결합하지 않은 염료는 465 nm에서 흡광하므로, 두 파장의 차이로 단백질 양을 정확히 가려낼 수 있습니다.
Q. Bradford와 BCA 중 어느 쪽을 써야 하나요?
Bradford는 빠르고(5분) 환원제·금속이온에 안정. 단점은 단백질 종류에 의존성이 큼. BCA는 단백질 의존성이 작고 정확하지만 환원제(DTT, β-ME)에 민감하고 30분 가열이 필요. 단순 정량에는 Bradford, 정확한 비교에는 BCA.
참고 표준·문헌
본 가이드는 다음 표준·교과서·핸드북의 정의·식·표준 절차를 따라 작성되었습니다. 학교 양식과 표준 절차가 다를 경우 학교 양식을 우선합니다.
- [1]Nelson, D.L., Cox, M.M. — Lehninger Principles of Biochemistry, 8th ed., Macmillan, 2021
- [2]Harris, D.C. — Quantitative Chemical Analysis, 10th ed., Freeman, 2020